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點(diǎn)擊次數(shù)：16915 發(fā)布時間：2022/12/26 11:43:03
三聚氰胺快速檢測試劑盒使用說明書
【測定原理】
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測牛奶和水產(chǎn)等樣本中的三聚氰胺，在微孔條上預(yù)包被上偶聯(lián)抗原，利用抗原與抗體的特異性免疫化學(xué)反應(yīng)的原理來進(jìn)行，樣本中的三聚氰胺和微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣品中的三聚氰胺含量與樣品的吸光度值呈反比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出三聚氰胺含量。
【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】
規(guī) 格：96孔/盒
靈 敏 度： 1ppb
檢測時間： 45min
樣本檢測下限：
奶 粉………………………………………………20 ppb
牛 奶………………………………………………16 ppb
牛 奶/奶 粉（處理法二）……………………… 1 ppb
組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）……………………2 ppb
飼 料 …………………………………………100 ppb
蛋 類 …………………………………………20 ppb
血 清 ………………………………………… 4 ppb
交叉反應(yīng)率
三聚氰胺 …………………………………………100%
三聚氰酸……………………………………………60%
三 嗪 ……………………………………………< 1%
三嗪二銨…………………………………………< 1%
回收率
牛 奶/奶 粉 ……………………………………90±15%
組 織 …………………………… 85±10%
飼 料 …………………………… 85±10%
蛋 類 …………………………… 80±10%
【試劑盒組成】
1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb
3、 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：×1瓶：（1ml/瓶） 1ppm
4、 酶標(biāo)記物 7ml………………… 紅色帽
5、 抗體工作液 7ml………………… 綠色帽
6、 底物A液 7 ml………………… 棕色帽
7、 底物B液 7 ml …………………黑色帽
8、 終止液 7 ml …………………黃色帽
9、 20X濃縮洗滌液40 ml……………白色帽
10、 2X濃縮復(fù)溶液 50 ml ……………藍(lán)色帽
【所用儀器、試劑】
具備的儀器：微孔板、酶標(biāo)儀、勻質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：單道 20ul～200ul、100ul～1000ul
多道 250 ul
試 劑： 乙腈 、氫氧化鈉 、濃鹽酸、去離子水、正己烷、甲醇
【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】
配液1、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。
配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按 所需用量配制洗滌液。
配液3 1M HCl 溶液取8.6ml濃HCl加去離子水定容至100ml。
配液4 1M NaOH 溶液稱取4g NaOH加去離子水定容至100ml。
配液5 0.1M NaOH 溶液稱取0.4g NaOH加去離子水定容100ml。
配液6 乙腈-0.1M NaOH溶液84ml乙腈和16ml 0.1M NaOH混合均勻。
【樣本前處理步驟】
樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、豬、牛、羊、兔、魚、蝦等。
（b）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（c）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
樣本處理方法
（a）牛奶專用樣本處理方法：
1、 取牛奶樣本600µl到2ml的離心管中，加入1ml乙腈，充分振蕩混勻；4000r/min以上離心5min；
2、 取100µl上清液，再加入500µl復(fù)溶液(見配液1)，混勻；
3、 取50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù):16倍
（b）奶粉；奶酪專用樣本處理方法：
1、稱取2.0±0.05g奶粉樣本至50ml離心管中，加入4ml甲醇，充分振蕩；
2、15℃4000r/min以上離心10min，取100µl上清液，再加入900µl復(fù)溶液(見配液1)，混勻；取50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù):20倍
（c）飼料樣品處理方法：
1、將飼料樣品研碎，稱2.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml去離子水均質(zhì)。
2、旋流1min，放振蕩器上振蕩2min15℃4000r/min以上離心15min，取出10ml上清液并用1M NaOH將pH值調(diào)至6-8。（注：因飼料樣品的不同，加入1M NaOH的量有所差異，根據(jù)情況調(diào)節(jié)，一般加入范圍是0.5ml—1ml之間）。
3、15℃，4000r/min以上離心15min，吸出上清液。（如果上清仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過濾）。
4、用稀釋后的復(fù)溶液10倍稀釋上清液（取100µl上清液加入900µl稀釋后的復(fù)溶液，并且混合均勻，混合30s）。
5、取50µl進(jìn)行分析樣本稀釋倍數(shù):100倍
（d）牛奶/奶粉樣本處理方法（處理法二）：
1、取2ml奶樣或2g奶粉至離心管中；加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min，取4ml上清液在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔?/font>至wan全干燥；
2、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；
3、取50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù)：1倍定量下限定為：2ppb
（e）組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）樣本處理方法：
1、取2.0±0.05g均勻組織樣本于50ml離心管中；加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min，取2ml上清液在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵羨an全干燥；
2、 用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；
3、 取50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù)：2 倍
（f）蛋類樣本處理方法：
1、用均質(zhì)器低速均勻樣本（蛋清、蛋黃或全蛋）稱取2.0±0.05g均質(zhì)過的樣本，加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min；（注：蛋清含蛋白成份高，加入提取液后會形成一團(tuán)膠狀物，較蛋黃或全蛋難易搖勻，此情況為正�，F(xiàn)象不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）15℃， 4000r/min以上離心10min，取1ml上清液在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵羨an全干燥；
2、 用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；
3、 取下層相用稀釋好的復(fù)溶液按1：3 （50µl樣本液加150µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋，混合30s；
4、 取50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù)：20倍
（g）血清樣本處理方法：
1、取0.5ml血清樣本于50ml離心管中；
2、加入2ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min，取1ml上清液在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵羨an全干燥；
3、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；
4、取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：4 倍
【酶標(biāo)免疫分析程序】
操作步驟：
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、、按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
4、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。
5、取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）
6、顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。
7、測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）。
【結(jié)果判定】
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與三聚氰胺的含量成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 1ppb為1.816；3ppb為1.415；9ppb為0.74；27ppb為0.313；81ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是27ppb-81ppb; 樣本2的濃度范圍是3ppb-9ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實(shí)際濃度。
2、定量判定：
所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第yi個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
| 百分吸光度值（%）＝ | B | ×100% |
| B0 |
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。
3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：
4、再現(xiàn)性：
由多個不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出三聚氰胺檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)三聚氰胺濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。
【注意事項(xiàng)】
1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒zui佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【儲存】
原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。
【有效期】
有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。
原創(chuàng)作者：上海極威生物科技有限公司
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