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點(diǎn)擊次數(shù)：18090 發(fā)布時(shí)間：2016/7/8 9:18:54
定性檢測(cè)血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中人寨卡病毒抗體（Zika virus Ab）的濃度。
使用試劑盒前，必須仔細(xì)閱讀本說(shuō)明書(shū)。
僅供科研使用，不得用于臨床診斷。
簡(jiǎn)介
寨卡病毒屬黃病毒科，黃病毒屬，單股正鏈RNA病毒，直徑20nm，是一種通過(guò)蚊蟲(chóng)進(jìn)行傳播的蟲(chóng)媒病毒，宿主不明確，主要在野生靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物和棲息在樹(shù)上的蚊子，如非洲伊蚊中循環(huán)。
該病毒*早于1947年偶然通過(guò)黃熱病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)在烏干達(dá)寨卡叢林的恒河猴中發(fā)現(xiàn)，隨后于1952年在烏干達(dá)和坦桑尼亞人群中發(fā)現(xiàn)。該病毒活動(dòng)一直比較隱匿，僅在赤道周?chē)姆侵�、美洲、亞洲和太平洋地區(qū)有寨卡病毒感染散發(fā)病例。*早一次暴發(fā)流行是2007年發(fā)生在西太平洋密克羅尼亞群島的雅鋪島，更大的一次流行于2013年-2014年發(fā)生在大洋洲的法屬波利尼西亞，感染了約32000人。
伊蚊還傳播黃病毒科中的另外三種病毒，包括登革熱病毒、基孔肯雅病毒和黃熱病毒，也主要在熱帶和亞熱帶地區(qū)流行。幾十年前，非洲的研究者注意到伊蚊傳播的寨卡病毒疫情莫名其妙地跟隨伊蚊傳播基孔肯雅病毒疫情之后。類(lèi)似的規(guī)律開(kāi)始于2013年，當(dāng)基孔肯雅病毒從西到東傳播時(shí)，寨卡病毒緊跟而來(lái)。
寨卡病毒病的潛伏期（從接觸到出現(xiàn)癥狀的時(shí)間）尚不清楚，可能為數(shù)天。寨卡病毒感染者中，只有約20%會(huì)表現(xiàn)輕微癥狀，典型的癥狀包括急性起病的低熱、斑丘疹、關(guān)節(jié)疼痛（主要累及手、足小關(guān)節(jié)）、結(jié)膜炎，其他癥狀包括肌痛、頭痛、眼眶痛及無(wú)力。另外少見(jiàn)的癥狀包括腹痛、惡心、嘔吐、黏膜潰瘍和皮膚瘙癢。癥狀通常較溫和，持續(xù)不到一周，需要住院治療的嚴(yán)重病情并不常見(jiàn)。2013年和2015年分別在法屬波利尼西亞和巴西塞卡疫情期間，有報(bào)道稱(chēng)寨卡病毒病可能會(huì)造成神經(jīng)和自身免疫系統(tǒng)并發(fā)癥。
2015年巴西的寨卡暴發(fā)流行中發(fā)現(xiàn)了很多小頭畸形的新生兒（出生的新生兒頭圍與匹配的相同性別和孕齡的孩子比，低于平均值超過(guò)了兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差）。在2015年5月-2016年1月間，共報(bào)道4000例感染寨卡病毒的孕婦分娩了小頭畸形兒，與往年小頭畸形的比例相比，上升了20倍。35例小頭畸形新生兒的頭顱CT及頭顱超聲提示存在彌漫性腦組織鈣化，主要發(fā)生在側(cè)腦室旁，薄壁組織旁和丘腦區(qū)域、基底節(jié)區(qū)域。皮質(zhì)和皮質(zhì)下萎縮造成的腦室萎縮也能見(jiàn)到。小部分嬰兒出現(xiàn)關(guān)節(jié)攣縮，提示周?chē)椭袠猩窠?jīng)系統(tǒng)受累。對(duì)寨卡疫情開(kāi)展調(diào)查發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的證據(jù)表明寨卡病毒與小頭癥之間存有關(guān)聯(lián)。然而，在解釋嬰兒小頭癥與寨卡病毒之間的關(guān)系之前仍需要做出更多調(diào)查。
實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒采用雙位點(diǎn)夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。在預(yù)包被人寨卡病毒（Zika virus）抗原（固相抗原）的微孔酶標(biāo)板中，加入人寨卡病毒抗體（Zika virus Ab）陰、陽(yáng)性對(duì)照和待測(cè)樣本，再加入HRP標(biāo)記的抗人免疫球蛋白（Anti Human Ig Ab）抗體（酶標(biāo)抗體），經(jīng)過(guò)溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體的夾心復(fù)合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下，*終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測(cè)樣品中人寨卡病毒抗體（Zika virus Ab）的濃度正相關(guān)。
試劑盒限制性
1、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。
2、在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用，過(guò)期產(chǎn)品不得使用。
3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。
4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。
5、如果樣本值高于標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，請(qǐng)將樣本適當(dāng)稀釋后，再重新測(cè)定。
6、待測(cè)樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)前，請(qǐng)排出該因素。
7、通過(guò)其他方法得到的檢測(cè)結(jié)果，與本試劑盒測(cè)定結(jié)果不具有直接的可比性。
技術(shù)提示
1、混合蛋白溶液時(shí)，避免起泡。
2、加校準(zhǔn)品與樣本時(shí)，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染。
3、合適的溫育時(shí)間，和充分的洗滌步驟，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件。
4、使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，加入一個(gè)30秒浸泡的步驟，可以提高檢測(cè)精度。
5、底物溶液為無(wú)色液體，保存過(guò)程中變?yōu)樗{(lán)色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。
6、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍(lán)色底物產(chǎn)物，會(huì)瞬間變?yōu)辄S色。
7、實(shí)驗(yàn)中，用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
8、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。
試劑盒組分與保存
| 未開(kāi)封的試劑盒保存在2-8度，不得使用過(guò)期試劑盒。組分 | 數(shù)量 | 主要成分 | 開(kāi)封后儲(chǔ)存 |
| 陰、陽(yáng)性對(duì)照 | 0.35ml/管 | －－ | 2-8℃1天 |
| 包被微孔板 | 96T | 預(yù)包被固相抗原 | 2-8℃14天 |
| HRP標(biāo)記抗體 | 6mL | HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體 | 2-8℃180天 |
| 底物液A | 6mL | 0.01%過(guò)氧化氫 | 2-8℃180天 |
| 底物液B | 6mL | 0.1%TMB | 2-8℃180天 |
| 30×濃縮洗滌液 | 20mL | 0.05%Tween20 | 2-8℃180天 |
| 說(shuō)明書(shū) | 1份 | －－ | －－ |
| 自封袋 | 1個(gè) | －－ | －－ |
| 不干膠 | 2片 | －－ | －－ |
其他用品
1、酶標(biāo)儀
2、精密移液器及一次性吸頭
3、蒸餾水
4、洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)
5、37℃水浴鍋或恒溫箱
6、500ml量筒
7、質(zhì)控品
生物安全
1、檢測(cè)必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置。
2、試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過(guò)敏反應(yīng)，避免吸入煙霧與皮膚接觸。
3、底物液對(duì)皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。
4、戴上防護(hù)手套，實(shí)驗(yàn)完成后徹底洗手。
樣品的采集和儲(chǔ)存
以下只是列出樣品采集和保存的一般指南。所有樣本采集保存過(guò)程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。
1、細(xì)胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min，去除細(xì)胞顆粒和聚合物，上清液保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。
2、血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。
3、血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。
樣本收集后，不是一次檢測(cè)完，請(qǐng)按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，使用時(shí)在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。
試劑準(zhǔn)備
1、使用前，所有的組分都要至少?gòu)?fù)溫30min，確保充分復(fù)溫到室溫。
2、濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會(huì)有結(jié)晶產(chǎn)生，這屬于正�，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完全溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:30稀釋?zhuān)?份的濃縮洗滌液，添加29份的蒸餾水。
3、底物：底物液A和B，在使用前，按1:1體積充分混合，混合后15分鐘內(nèi)使用。
操作程序
所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔。
1、按前面說(shuō)明書(shū)描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。
2、從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。
3、設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照孔、樣本孔，陰陽(yáng)性對(duì)照孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。
4、樣本孔加待測(cè)樣本50μL。
5、所有孔中加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL。
6、用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
7、揭開(kāi)封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次。若使用自動(dòng)洗板機(jī)，請(qǐng)按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高檢測(cè)的精度。洗板結(jié)束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應(yīng)板。
8、將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。
9、所有孔加入終止液50μL，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）。
結(jié)果計(jì)算
1、試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00；
陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.2。
2、臨界值（Cut off）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15
3、陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性
4、陽(yáng)性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off），樣品為陽(yáng)性
試劑盒性能指標(biāo)
1、物理性能
試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無(wú)沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無(wú)破損漏氣。
2、精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。批間變異系數(shù)CV%小于15%。
3、特異性
本試劑盒識(shí)別天然和重組人寨卡病毒抗體（Zika virus Ab），與結(jié)構(gòu)類(lèi)似物無(wú)交叉。
4、穩(wěn)定性
2℃-8℃保存，有效期6個(gè)月。
原創(chuàng)作者：上海極威生物科技有限公司
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