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公司新聞

極威生物為新員工培訓(xùn)ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作及技術(shù)服務(wù)的常見問題分析

點(diǎn)擊次數(shù):1236   發(fā)布時(shí)間:2016/4/20 16:10:12

今天下午,極威生物elisa技術(shù)老師陳老師為公司新入職員工進(jìn)行了簡單了培訓(xùn) ,主要培訓(xùn)內(nèi)容如下:
一、ELISA實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)有哪些?
1、Elisa實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作要點(diǎn):優(yōu)質(zhì)的試劑

  實(shí)驗(yàn)的基本條件是:優(yōu)質(zhì)的試劑,良好的儀器和正確的操作是保證ELISA 檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水,包括用于洗滌的,應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的來使用,本公司要求使用的純化水電導(dǎo)率小于1.5μs/cm

 2、 Elisa實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)之二:標(biāo)本的采取

很多實(shí)驗(yàn),基本上大部分ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測的樣本均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集(具體采集方法可以咨詢相關(guān)業(yè)務(wù)員),采集過程中,應(yīng)注意避免溶血,紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),以HRP 為標(biāo)記的ELISA 測定中,溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。另外血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測。如有細(xì)菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。

二、Elisa實(shí)驗(yàn)操作前樣本的保存方法

  一般說來,在一周內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃,標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過長容易導(dǎo)致血清IgG 聚合,使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需-20℃保存。凍結(jié)血清融解后,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均,應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾,澄清后再檢測。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落,所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測,宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無菌操作,也可加入適當(dāng)防腐劑。抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性,建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。

三、Elisa實(shí)驗(yàn)過程中注意的事項(xiàng):加樣,保溫,洗板及注意事項(xiàng)

1、加樣:實(shí)驗(yàn)過程中,加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA 板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出。保溫工作

在建立ELISA 方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí),實(shí)驗(yàn)表明,兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)

1-2 小時(shí),產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋,也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,反應(yīng)板不宜疊放,以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成,采用水浴會(huì)造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應(yīng),邊上的值會(huì)偏高,建議為了客觀的判斷結(jié)果,將質(zhì)控放在非邊緣位置。
3、Elisa洗滌過程注意事項(xiàng)

ELISA實(shí)驗(yàn)過程中洗滌雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟,但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA 主要就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,而在洗滌時(shí)應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?梢哉f在ELISA 操作中,洗滌是*主要的關(guān)鍵技術(shù),應(yīng)引起操作者的高度重視,操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌,不得馬虎。

4、Elisa洗滌液

洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的,非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán),也含親水基團(tuán),其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合,從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合,并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用,使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài),從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,其濃度可在0.05%-0.2%之間,高于0.2%時(shí),可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。

 5、Elisa洗板時(shí)注意事項(xiàng)  

洗板時(shí)注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋,應(yīng)按要求稀釋,所用的水電導(dǎo)率在1.5us/cm 之下,洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制。保證洗板浸泡時(shí)間為40 秒左右,孔內(nèi)液體被洗板機(jī)吸收得越干凈洗滌效果更好,手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。

Elisa實(shí)驗(yàn)的顯色和比色

TMB 經(jīng)HRP 作用后,約40 分鐘顯色達(dá)頂峰,隨即逐漸減弱,至小時(shí)后即可完全消退至無色。TMB 的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長時(shí)間(12-24 小時(shí))不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各類酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色,此時(shí)可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀,通常指專用于測讀ELISA 結(jié)果吸光度的光度計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有:測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001,準(zhǔn)確性為±1%,重復(fù)性達(dá)0.5%。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下,操作時(shí)室溫宜在15~30℃,使用前先預(yù)熱儀器15-30 分鐘,測讀結(jié)果更穩(wěn)定。

測讀值時(shí),要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰,如OPD 492nm 波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀,即每孔先后測讀兩次,次在*適波長(W1),第二次在不敏感波長(W2),兩次測定間不 移動(dòng)ELISA 板的位置,*終測得的值為兩者之差(W1-W2)。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

四、Elisa實(shí)驗(yàn)本底及假陽性產(chǎn)生的原因分析

1. 基因工程(Genetic Engineering)抗原與合成肽抗原的區(qū)別

1.1 基因工程(Genetic Engineering)抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原,多以大腸桿菌(Escherichia coli)或酵母菌為表達(dá)系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn):

a.分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備,由于工藝的局限,合成數(shù)量有限,只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸;而利用基因工程(Genetic Engineering)制備的抗原,分子量更大。
 這次的培訓(xùn)給新員工帶來了很多的收獲,好幾個(gè)員工表示,之前很多客戶問的一些問題都無法回答上來,經(jīng)過這次的培訓(xùn)后,以后在跟客戶交談中,如果遇到以上的一些問題,可以立馬給客戶解答,能夠更好的,更專業(yè)的為客戶服務(wù),自己也收獲了很多的知識!

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